Wejściówki 1 i 2

Standardowa droga od wycinka do szkiełka barwionego HE. Cała procedura trwa 1–3 dni. Kolejność to częste pytanie, a giełda lubi pytać o pojedyncze sąsiednie etapy.

1. Pobranie — cienki fragment (przy utrwalaniu immersyjnym co najmniej jeden wymiar ≤ ~0,5 cm, inaczej środek ulegnie autolizie).
2. Utrwalenie — najczęściej buforowana formalina (do mikroskopii świetlnej).
3. Odwodnienie — szereg alkoholi o rosnącym stężeniu: 50 → 70 → 80 → 90 → 100%. Woda nie miesza się z parafiną.
4. Prześwietlanie — płyn pośredni (ksylen, toluen, benzen) wypiera alkohol; tkanka staje się przejrzysta, a ksylen miesza się z parafiną.
5. Przepajanie — płynna parafina w cieplarce, 52–60 °C; ksylen odparowuje, parafina wnika w tkankę.
6. Zatapianie — formowanie bloczka parafinowego, który twardnieje w temperaturze pokojowej.
7. Krojenie — mikrotom (rotacyjny: taśma skrawków seryjnych; saneczkowy: nóż się porusza, skrawki pojedyncze), grubość 4–10 µm (zwykle 5–7 µm).
8. Naklejenie na szkiełko podstawowe (skrawek rozprostowuje się na ciepłej wodzie).
9. Odparafinowanie (ksylen) → nawodnienie (alkohole malejące 100 → 50%) → woda, bo barwniki HE są wodne.
10. Barwienie: hematoksylina → płukanie w wodzie bieżącej → eozyna.
11. Odwodnienie → ksylen → zamknięcie w balsamie kanadyjskim lub żywicy pod szkiełkiem nakrywkowym.

Cele utrwalania

• Natychmiastowe zatrzymanie metabolizmu i autolizy (denaturacja enzymów, zwłaszcza proteolitycznych) oraz ochrona przed gniciem bakteryjnym.
• Związanie i wytrącenie (precypitacja) składników, żeby nie dyfundowały i nie zaciemniały obrazu.
• Wstępne utwardzenie materiału i zwiększenie odporności na dalsze odczynniki.
• Czasem poprawa barwliwości (utrwalacz dobiera się do metody barwienia).

Mechanizm aldehydów: formaldehyd i aldehyd glutarowy reagują z grupami aminowymi (–NH₂) białek i sieciują je, co blokuje enzymy i utrwala strukturę.

Cechy dobrego utrwalacza

Szybko wnika w tkankę · szybko stabilizuje struktury (denaturacja białek) · nie niszczy struktur wewnątrzkomórkowych · jest izotoniczny względem płynu tkankowego · mało toksyczny. Nie ma utrwalacza uniwersalnego.

Metody

• Chemiczne: immersyjne (zanurzenie wycinka) i perfuzyjne (utrwalacz wprowadzony przez naczynia krwionośne; duże narządy, zwierzęta doświadczalne).
• Fizyczne: mikrofale. Podobny efekt daje szybkie zamrożenie.

Formalina to ok. 37–40% roztwór formaldehydu; w praktyce stosuje się ją rozcieńczoną i buforowaną (ok. 4% formaldehyd, czyli „10% formalina”).

Skrawki mrożeniowe

Tkankę zamraża się szybko (ciekły azot −196 °C, izopentan schłodzony azotem, suchy lód −78,5 °C) i kroi w kriostacie (mikrotom w komorze chłodzącej).

• Zalety: szybkość (kilkanaście minut, dlatego badanie śródoperacyjne, np. ocena marginesów guza); zachowuje lipidy (brak alkoholi i ksylenu, więc można barwić Sudanem) i aktywność enzymów (histochemia enzymów); brak denaturacji cieplnej (immunohistochemia).
• Wady: grubsze skrawki, gorsza morfologia, kryształy lodu niszczą struktury.
• Krioprotekcja: przepojenie sacharozą (15–30%), glicerolem (10–30%) lub DMSO (10%) zapobiega krystalizacji wody.
• Liofilizacja: suszenie zamrożonego materiału w próżni przez sublimację wody.

Żywice

Żywice epoksydowe i akrylowe są twardsze od parafiny, więc dają cieńsze skrawki. Akrylowe nie wymagają wysokiej temperatury. Żywica epoksydowa jest standardem w TEM.

Rodzaje preparatów mikroskopowych

Skrawki · szlify (twarde: kość, zębina, szkliwo) · rozmazy (krew, szpik, biopsja cienkoigłowa) · rozgnioty · odciski narządowe · hodowle komórkowe (żywe, bez utrwalania) · preparaty całościowe (np. skórka łuski cebuli z ćw. 1).

HE: jądra fioletowo-niebieskie, cytoplazma i kolagen różowe. Preparat w odcieniach fioletu i różu to najpewniej HE.

Słowniczek barwienia

• Progresywne: przerywamy, gdy osiągniemy pożądaną barwę (trwalsze).
• Regresywne: przebarwiamy, potem odbarwiamy (różnicujemy), np. zakwaszoną wodą.
• Polichromatyczne: mieszanina barwników zasadowych i kwaśnych naraz, np. May-Grünwald-Giemsa (krew).
• Przyżyciowe: barwnik podany do żywego organizmu lub komórki; mało toksyczny (czerwień obojętna, błękit metylenowy, zieleń Janusowa, tusz chiński).
• Metachromazja: struktura barwi się na inny kolor niż barwnik. Ziarna komórek tucznych (heparyna) po błękicie toluidyny są różowofioletowe zamiast niebieskich, bo cząsteczki barwnika tworzą dimery pochłaniające inną długość fali.
• Bejcowanie: zaprawa (np. sole glinu dla hematoksyliny) wiąże barwnik z tkanką.
• Impregnacja metalami: sole srebra (włókna siateczkowe, neurony, aparat Golgiego) lub złota.

Lokalizowanie w komórkach i tkankach konkretnych substancji chemicznych lub enzymów przez reakcję, której produkt jest barwny (lub gęsty elektronowo) i nierozpuszczalny, więc zostaje w miejscu powstania.

• PAS (dwuetapowa): kwas nadjodowy utlenia grupy glikolowe cukrów do aldehydowych → odczynnik Schiffa wiąże aldehydy i daje kolor magenty. Wykrywa glikogen, glikoproteiny, mucyny, glikokaliks, błonę podstawną. PAS z diastazą: jeśli kolor znika po trawieniu amylazą, był to glikogen.
• Feulgen (dwuetapowa): łagodna hydroliza HCl odsłania grupy aldehydowe deoksyrybozy → odczynnik Schiffa. Wykrywa tylko DNA (jądro).
• Brachet: zieleń metylowa (DNA) + pironina (RNA): jąderko i cytoplazma bogata w rybosomy na czerwono.
• Sudan: zasada fizyczna, barwnik lepiej rozpuszcza się w tłuszczach niż w wodzie.
• Perls (żelazo), błękit alcjanowy (kwaśne GAG), FIF (fluorescencja indukowana formaldehydem: aminy biogenne).

Histochemia (cytochemia) enzymów

Wykrywa aktywność enzymu, a nie samo białko. Wymaga materiału mrożonego lub łagodnie utrwalonego. Skrawek inkubuje się z substratem; produkt reakcji wytrąca się (np. metoda Gomoriego: produkt wiązany jonami metali, Pb²⁺, w nierozpuszczalny osad).

Inne enzymy wykrywane histochemicznie: fosfatazy, dehydrogenazy, peroksydazy.

Cząsteczki o dużym powinowactwie (znaczniki)

Falloidyna (toksyna grzyba) wiąże F-aktynę · białko A (z gronkowca) wiąże przeciwciała · lektyny wiążą określone reszty cukrowe glikoprotein i glikolipidów. Znakuje się je fluorochromem, enzymem lub złotem.

Immunohistochemia (immunocytochemia)

Wykorzystuje bardzo wysoką swoistość wiązania przeciwciała z antygenem (konkretnym epitopem). Miejsce związania przeciwciała pokazuje lokalizację białka. Przeciwciała znakuje się:

• fluorochromem (immunofluorescencja),
• enzymem (peroksydaza chrzanowa, fosfataza zasadowa), który potem daje barwny produkt w reakcji,
• złotem koloidalnym lub ferrytyną (ziarenka widoczne w TEM).

Poliklonalne: z surowicy immunizowanego zwierzęcia; wiążą wiele epitopów, niższa swoistość. Monoklonalne: z jednego klonu komórek, jeden epitop, wysoka swoistość. Otrzymuje się je przez fuzję limfocytu B immunizowanego zwierzęcia z komórką szpiczaka → hybrydoma (dzieli się bez końca i wytwarza jedno przeciwciało).

Zastosowania: typowanie nowotworów (np. cytokeratyny w raku), odróżnienie limfocytów B od T (antygeny CD, niewidoczne w MGG), wykrycie insuliny i glukagonu w wyspach trzustki, receptorów, białek cyklu (PCNA, p53).

Hybrydyzacja in situ (hybrydocytochemia)

Wykrywa w preparacie odcinek DNA lub RNA o znanej sekwencji. Kroki: ogrzanie (denaturacja, rozdzielenie nici) → inkubacja z sondą (komplementarny DNA/RNA, znakowany izotopem, fluorochromem lub antygenem) → wykrycie sondy. Wariant fluorescencyjny to FISH. Przy bardzo małej ilości kwasu nukleinowego stosuje się PCR in situ.

Zastosowania: lokalizacja genu na chromosomie, liczba kopii genu, ekspresja genu (swoisty mRNA), wykrycie wirusów (np. mRNA HPV w nabłonku przy użyciu znakowanego cDNA — pytanie z giełdy).

Autoradiografia

Lokalizuje nowo syntetyzowane makrocząsteczki. Żywym komórkom podaje się radioaktywny prekursor (np. ³H-tymidyna → DNA w fazie S; ³H-leucyna → białka), który wbudowuje się w makrocząsteczki. Skrawki pokrywa się w ciemni emulsją fotograficzną (AgBr), eksponuje i wywołuje; nad miejscami znakowanymi powstają czarne ziarna srebra. Działa w mikroskopii świetlnej i TEM; pozwala śledzić dynamikę procesów (np. drogę białka RER → AG → ziarna wydzielnicze).

• Kondensor zbiera i skupia stożek światła na preparacie.
• Przesłona (z pokrętłem jasności) reguluje ilość światła i kontrast.
• Obiektyw daje pierwsze powiększenie i decyduje o rozdzielczości (apertura numeryczna jest na nim wypisana, np. „0,65/63×”).
• Okular dodatkowo powiększa obraz z obiektywu i rzutuje go na siatkówkę lub kamerę.

Obraz: pozorny, powiększony, odwrócony.

Powiększenie całkowite = powiększenie obiektywu × okularu (× pośredniego układu optycznego). Np. 40× · 10× = 400×.

Zdolność rozdzielcza

Najmniejsza odległość między dwoma punktami, przy której widzimy je jako oddzielne. Im mniejsza liczba, tym lepiej.

d = 0,61 · λ / A    gdzie   A = n · sin α

λ: długość fali; A: apertura numeryczna obiektywu; n: współczynnik załamania ośrodka między preparatem a soczewką; α: połowa kąta wpadania światła. Lepsza rozdzielczość: krótsza fala (niebieskie, UV) i większa apertura (immersja).

Immersja: kropla olejku immersyjnego (n ≈ 1,52, jak szkło) między obiektywem 100× a szkiełkiem usuwa warstwę powietrza, zwiększa n i aperturę, więc poprawia rozdzielczość. Obsługa immersji jest sprawdzana na ostatnich ćwiczeniach semestru.

Powiększenie puste: wynika z ograniczonej zdolności rozdzielczej oka. Gdy zwiększamy powiększenie okularu bez zmiany apertury obiektywu, obraz tylko się rozciąga i nie ujawnia nowych szczegółów. Powiększenie użyteczne ≈ 500–1000 × A.

Jednostki: 1 Å = 0,1 nm · 1 µm = 1000 nm · 1 mm = 1000 µm · erytrocyt ≈ 7 µm (wygodna miarka na każdym preparacie).

Przekroje: skrawek ma 4–10 µm, więc oglądamy obraz dwuwymiarowy; ta sama cewa lub komórka wygląda zupełnie inaczej w przekroju podłużnym, poprzecznym i skośnym.

Konfokalny — zalety: ostry obraz bez poświaty z innych warstw, 3D/4D, lepsza rozdzielczość niż zwykły świetlny, żywe preparaty. Wady: blaknięcie barwnika, fototoksyczność, powolność, cena, nadal gorsza rozdzielczość niż TEM.

Przygotowanie do TEM

1. Utrwalenie aldehydem glutarowym (sieciuje białka), potem czterotlenkiem osmu (utrwala lipidy i błony, daje kontrast).
2. Odwodnienie, zatopienie w żywicy epoksydowej.
3. Krojenie ultramikrotomem nożem szklanym lub diamentowym na skrawki ultracienkie, ok. 40–90 nm (Seminaria: 20–50 nm; świetlny 1–10 µm).
4. Kontrastowanie solami metali ciężkich: octan uranylu, cytrynian ołowiu.

Metody specjalne TEM

• Barwienie negatywowe: barwnik wypełnia przestrzenie wokół drobnych struktur (wirusy, kompleksy białek), które wychodzą jasne na ciemnym tle.
• Cieniowanie: napylenie platyny pod kątem; warstewka metalu oddzielona od preparatu to replika.
• Mrożenie i łamanie (freeze-fracture): zamrożony materiał łamie się w próżni wzdłuż płaszczyzny najmniejszego oporu, czyli środkiem dwuwarstwy lipidowej; z przełomu robi się replikę. Widać białka integralne jako cząstki na powierzchniach P i E oraz połączenia międzykomórkowe. Odmiana: głębokie trawienie (deep etching) pokazuje cytoszkielet.
• Immunozłoto: przeciwciała znakowane złotem koloidalnym.

Izolacja, homogenizacja, frakcjonowanie

• Izolacja komórek: mechaniczne rozdrobnienie tkanki + enzymy trawiące substancję międzykomórkową (kolagenaza, trypsyna, dyspaza) + łagodne wirowanie. Separacja wybranych typów: cytometr z sorterem (FACS) albo kulki magnetyczne (dynabeads, MACS). Komórki z guza lub węzła chłonnego można pobrać biopsją cienkoigłową (prof. Woyke wprowadził ją w Polsce).
• Homogenizacja: zniszczenie błony komórkowej (tłok, ultradźwięki/sonikacja, detergent, przeciskanie pod ciśnieniem) → homogenat.
• Wirowanie różnicowe: wielokrotne wirowanie przy rosnącej prędkości; po każdym cyklu osad zawiera najcięższe struktury, a nadsącz wiruje się dalej.

1. mała prędkość: całe komórki, jądra, cytoszkielet
2. średnia: mitochondria, lizosomy, peroksysomy
3. duża: mikrosomy (fragmenty ER), małe pęcherzyki
4. bardzo duża: rybosomy, wirusy, duże cząsteczki

Wirowanie w gradiencie gęstości (sacharoza, chlorek cezu): frakcje układają się w osobne warstwy na różnej wysokości probówki.

Hodowle komórek

• Hodowla pierwotna: komórki prosto z tkanki; etapy: izolacja fragmentu → enzymatyczne rozproszenie (kolagenaza) → liczenie żywych i martwych → wysiew → pożywka. Ograniczona liczba podziałów.
• Ustalona linia komórkowa (nieśmiertelna, immortalizowana): pasażowana bez końca, stały genotyp i fenotyp. Immortalizacja spontaniczna (rzadko, np. niskie Ca²⁺) albo przez transfekcję onkogenami (antygen T wirusa SV40, E1A/E1B adenowirusa, zmutowany p53, ha-ras), co inaktywuje geny kontroli cyklu (p53, Rb).
• Fuzja komórek: połączenie błon i cytoplazmy dwóch komórek → heterokarion (dwa różne jądra) → hybryda. Hybrydoma = limfocyt B + szpiczak → przeciwciała monoklonalne (np. anty-CD20 w chłoniakach).
• Wykład: inkubacja < 24 h, hodowla > 24 h; hodowle ogląda się w odwróconym mikroskopie kontrastowo-fazowym.

Białka i kwasy nukleinowe

• Elektroforeza: ruch naładowanych cząstek w polu elektrycznym; szybkość zależy od ładunku, wielkości i kształtu. DNA: żel agarozowy (po pocięciu enzymami restrykcyjnymi).
• SDS-PAGE: żel poliakrylamidowy z SDS. SDS (anionowy detergent) rozbija kompleksy, denaturuje białka i nadaje im ładunek ujemny proporcjonalny do długości, więc białka rozdzielają się według masy cząsteczkowej. Merkaptoetanol redukuje mostki disiarczkowe.
• Ogniskowanie izoelektryczne: gradient pH; białko zatrzymuje się w swoim punkcie izoelektrycznym. Elektroforeza dwukierunkowa (IEF, potem SDS-PAGE prostopadle) rozdziela ok. 1000 białek.
• Blotting: przeniesienie z żelu na błonę nitrocelulozową, potem identyfikacja. Southern = DNA (sonda), Northern = RNA (sonda), Western = białka (przeciwciała). Bardzo czuły (ok. 10 pg).
• Klonowanie: enzymy restrykcyjne tną DNA w określonych sekwencjach → rekombinowany DNA → plazmidy w bakteriach. Biblioteki genomowe (całe DNA, z częściami niekodującymi) i cDNA (z mRNA przez odwrotną transkryptazę; tylko geny ulegające ekspresji).
• Transfekcja: wprowadzenie DNA do komórki: wirusy, elektroporacja, sonoporacja, nanocząstki złota. Zwierzęta transgeniczne i knock-out.
• Sekwencjonowanie Sangera: synteza nici komplementarnej z dodatkiem znakowanych dideoksynukleotydów, które przerywają wydłużanie → fragmenty różnej długości → elektroforeza → odczyt sekwencji. NGS: biblioteka DNA → amplifikacja → masowe równoległe sekwencjonowanie; diagnostyka genetyczna, onkologia.
• Mikromacierze DNA: płytka z tysiącami sond; znakowany cDNA z komórki hybrydyzuje, fluorescencja pokazuje ekspresję tysięcy genów naraz (badania przesiewowe).
• PCR: wykrycie śladowych ilości DNA; polimeraza w cyklach syntezy powiela odcinek wykładniczo (Mullis 1983, Nobel 1993). RT-PCR: dla RNA, odwrotna transkryptaza robi cDNA, potem PCR. qPCR: pomiar przyrostu produktu w czasie rzeczywistym przez fluorescencję (SYBR Green świeci ok. 1000× silniej po związaniu dsDNA); ilościowa analiza ekspresji mRNA.

Funkcja komórki na żywo

• Mikroelektrody jonoselektywne mierzą wewnątrzkomórkowe stężenia jonów. Patch clamp (technika łatkowa): elektroda przywiera do małej „łatki” błony bez jej przebijania i rejestruje prąd przez pojedynczy kanał jonowy.
• Znaczniki w żywych komórkach: barwniki swoiste dla organelli; wskaźniki zmieniające fluorescencję zależnie od jonów, pH lub potencjału błonowego; śledzenie (tracing) wypustek neuronów. Wprowadzanie: endocytoza, mikroiniekcja, liposomy.
• FRET: transfer energii z jednego fluorochromu (donora) na drugi (akceptor) tylko gdy są bliżej niż ~10 nm; zmienia się barwa fluorescencji. Bada interakcje i zmiany konformacji białek, wiązanie ligandów, fuzję błon.
• GFP (zielone białko fluorescencyjne z meduzy): gen GFP łączy się z genem badanego białka → białko fuzyjne świeci w żywej komórce i działa normalnie. Odmiany barwne pozwalają śledzić kilka białek; GFP bywa genem reporterowym.

Cytometria przepływowa

Zawiesina komórek przepływa pojedynczo w cienkim strumieniu przez wiązkę lasera. Detektory mierzą rozproszenie światła (wielkość, ziarnistość) i fluorescencję znaczników (np. przeciwciał). Sorter nadaje kroplom ładunek (+, −, 0) i pole elektryczne kieruje je do różnych pojemników. Bada się kształt i wielkość, żywotność, apoptozę, zawartość DNA i ploidię, antygeny (np. liczba limfocytów CD4⁺), pH, jony. Diagnostyka białaczek, chłoniaków (niska ekspresja CD45), zaburzeń odporności. Pionier: prof. Zbigniew Darżynkiewicz (metoda TUNEL do wykrywania fragmentacji DNA w apoptozie).

Inne

Mikromacierze tkankowe (TMA): setki małych fragmentów tkanek w jednym bloczku parafinowym → jeden skrawek do IHC/FISH; diagnostyka molekularna nowotworów. Cyfrowa analiza obrazu: poprawa jasności i kontrastu, pomiary morfometryczne (liczba, pole, obwód), rekonstrukcja 3D, wideomikroskopia procesów w żywych komórkach.

Srebrzony zwój międzykręgowy: aparat Golgiego widoczny w mikroskopie świetlnym jako ciemna sieć nitek wokół jądra w perykarionie (impregnacja srebrem, metoda Golgiego).

• Grubość 7,5–10 nm; widoczna tylko w TEM (po utrwaleniu OsO₄) jako struktura trójwarstwowa: dwie ciemne linie i jasny środek.
• Dwuwarstwa lipidowa z amfipatycznych lipidów: glicerofosfolipidy (fosfatydy), sfingolipidy (sfingomielina, glikosfingolipidy) i sterole (cholesterol — jedyny sterol błon ssaków). Na jedno białko przypada kilkadziesiąt cząsteczek lipidów; białka to ok. 50% masy błony.
• Model płynnej mozaiki (uzupełniony o domeny): lipidy i białka wykonują ruchy lateralne (boczne) i rotacyjne; przejście między warstwami (flip-flop) jest spontanicznie bardzo wolne. Cytoszkielet ogranicza ruch białek.
• Cholesterol wciska się między fosfolipidy, ogranicza ich ruch, zmniejsza płynność i stabilizuje błonę; buduje tratwy lipidowe i kaweole.
• Płynność zależy też od kwasów tłuszczowych: nasycone i długie łańcuchy zmniejszają płynność, nienasycone (wiązania podwójne) zwiększają.
• Synteza lipidów: glicerofosfolipidy i cholesterol w ER (warstwa P); sfingolipidy zaczynają się w ER (ceramid), kończą w aparacie Golgiego (glikozylacja, sfingomielina).

Funkcje błony

Selektywna bariera · utrzymanie stałego składu jonowego i gradientu elektrochemicznego · transport · odbiór i przekazywanie sygnałów (receptory) · rozpoznawanie i adhezja (glikokaliks, integryny łączące cytoszkielet z macierzą) · połączenia międzykomórkowe.

Skąd asymetria (Seminaria rozdz. 6)

• Flipazy (translokaza aminofosfolipidów): przenoszą PS i PE z warstwy E do P; swoiste, wymagają ATP.
• Flopazy (białka oporności wielolekowej, MDR): przenoszą lipidy z P do E; mało swoiste, wymagają ATP.
• Skramblaza: miesza lipidy obu warstw, bez energii; aktywowana wzrostem Ca²⁺ i w apoptozie (fosfatydyloseryna wychodzi na zewnątrz, co jest sygnałem dla makrofagów).
• Glikosfingolipidy powstają po stronie światła aparatu Golgiego; po fuzji pęcherzyka z błoną ta strona staje się zewnętrzna, a cukry utrudniają przejście na stronę P.
• Asymetria lateralna = różne domeny w płaszczyźnie błony.

Domeny błonowe

Fragmenty o innych właściwościach niż reszta błony. Tworzą je: połączenia zamykające nabłonka (dzielą błonę na domenę apikalną i bazolateralną; duże, trwałe), miejsca adhezji do macierzy, miejsca kontaktu z cytoszkieletem, oddziaływania lipid–lipid i lipid–białko.

• Tratwy lipidowe: dużo cholesterolu i sfingolipidów (nasycone, długie łańcuchy) → stan ciekły uporządkowany, mniejsza płynność, słabo rozpuszczalne w detergencie Triton X-100 w 4 °C. Skupiają białka sygnalizacji (receptory, kinazy), białka GPI i białka palmitylowane, przez co ich oddziaływania są wydajniejsze.
• Kaweole: regularne wgłębienia błony o średnicy 50–100 nm, jedna z form tratw. Zbudowane z udziałem kaweolin (kaweolina-1: adipocyty, fibroblasty, nabłonek, śródbłonek; kaweolina-3: mięśnie) i kawin. Funkcje: endocytoza i transcytoza, regulacja cholesterolu, przekazywanie sygnałów (receptory insuliny, białka G, kinazy Src, syntaza NO). W adipocytach insulina gromadzi tu GLUT4.

Funkcje białek błonowych: transport (kanały, nośniki, pompy) · receptory · enzymy · przekazywanie sygnału · adhezja i połączenia · wzmocnienie mechaniczne (łączenie z cytoszkieletem).

Wbudowywanie białek do błony

• Kotranslacja: N-końcowa sekwencja sygnałowa (ok. 20 hydrofobowych aminokwasów) wiąże SRP (cząstkę rozpoznającą sygnał); rybosom przyłącza się do RER, łańcuch przechodzi przez kanał (translokon) w trakcie syntezy; sekwencja sygnałowa jest odcinana, a kolejny odcinek hydrofobowy kotwiczy białko w błonie (np. glikoforyna, HLA: N-koniec na zewnątrz).
• Fałdowanie zależne od błony: rozpuszczalne białko przyjmuje w kontakcie z błoną konformację pozwalającą się wbudować (cytochrom b5, oksydaza cytochromowa).

Kotwice lipidowe

Seminaria: acylacja i prenylacja zwiększają hydrofobowość białek, ale tylko reszta palmitynowa sprzyja występowaniu w tratwach lipidowych.

Erytrocyt utrzymuje kształt dwuwklęsłej soczewki i odkształca się w kapilarach dzięki szkieletowi błony (sieć białek pod błoną, w odróżnieniu od głębiej leżącego cytoszkieletu).

• Białka integralne: glikoforyna (131 aminokwasów, jedna α-helisa, połowa masy to cukry) i białko prążka 3 (wymiennik anionów Cl⁻/HCO₃⁻, dimer tworzy kanał; wiele helis; nośnik antygenów ABH).
• Białka powierzchniowe szkieletu: spektryna (dimery α i β, długie ~100 nm „sznury” tworzące sieć), ankiryna (białko prążka 2.1, wiąże spektrynę z białkiem prążka 3), białko prążka 4.1 i F-aktyna (łączą spektrynę z glikoforyną), adducyna, tropomiozyna.
• Wrodzone defekty spektryny/ankiryny → nieprawidłowy kształt (sferocytoza), łatwa hemoliza, niedokrwistość. Podobne białka w innych komórkach to fodryny.

CD45 (wspólny antygen leukocytów): białko integralne leukocytów, jedna helisa, glikozylowana część zewnętrzna, w części cytoplazmatycznej aktywność fosfatazy tyrozynowej; wiąże fodrynę. Niższa ekspresja w komórkach chłoniaków (cytometria przepływowa).

Glikokaliks

Warstwa łańcuchów oligosacharydowych glikolipidów i glikoprotein (oraz proteoglikanów) na zewnętrznej powierzchni komórki. Funkcje: ochrona, rozpoznawanie i oddziaływania między komórkami, adhezja, antygenowość (grupy krwi A, B, H na glikosfingolipidach i białku prążka 3; nie ma ich na neuronach), receptory. Przykład: w zapaleniu selektyny E i P śródbłonka wiążą cukry leukocytów (a selektyny L leukocytów cukry śródbłonka) → przyleganie i wyjście leukocytów z naczynia. Barwi się metodą PAS.

Uniport: jedna substancja w jednym kierunku. Kotransport: dwie substancje zależne od siebie: w tym samym kierunku = symport, w przeciwnych = antyport (wymiennik jonowy).

Cechy transportu przez nośniki (Seminaria)

• Wysycalny: szybkość rośnie ze stężeniem tylko do V_max (wszystkie nośniki zajęte); V_max mówi o liczbie nośników, K_m o powinowactwie (wykres Lineweavera–Burka). Dyfuzja prosta rośnie liniowo.
• Stereoswoisty: L-leucyna wnika do komórek znacznie szybciej niż D-leucyna.
• Podobne cząsteczki konkurują o nośnik.

Transportery glukozy

Pompy i kanały

• Pompa Na⁺/K⁺ (ATPaza Na⁺/K⁺): wypompowuje 3 Na⁺, wprowadza 2 K⁺ na 1 ATP; fosforylacja i dwie zmiany konformacji. Podjednostki α (10 helis, wiąże ATP), β (1 helisa, mostki disiarczkowe), γ. Zużywa ok. 25% ATP komórki. Umożliwia przewodzenie sygnałów w neuronach i mięśniach, transport wtórny i utrzymanie objętości komórki (bez niej komórka nabrzmiewa i pęka). Hamują ją glikozydy nasercowe.
• Pompa Ca²⁺: w błonie komórkowej i w błonie siateczki sarkoplazmatycznej (SERCA); stężenie Ca²⁺ w cytoplazmie ok. 0,1 µM, ponad 10 000 razy niższe niż na zewnątrz. Kanały uwalniające Ca²⁺ z siateczki = receptory rianodynowe.
• Pompa protonowa: zakwasza wnętrze lizosomów (aktywuje enzymy). W mitochondriach H⁺ płynie zgodnie z gradientem przez syntazę ATP.
• Kanały jonowe: kanał K⁺ = 4 identyczne podjednostki po 6 α-helis; helisa S4 z ładunkami dodatnimi to czujnik napięcia. Kanał Na⁺ = jeden łańcuch z 4 domenami podobnymi do podjednostki kanału K⁺; kanał Ca²⁺ podobny do Na⁺.
• Oporność wielolekowa (MDR): P-glikoproteina (170 kDa, 2 × 6 helis, 2 miejsca wiążące ATP = kaseta ABC) i białko MRP aktywnie wyrzucają z komórki toksyny, antybiotyki i cytostatyki. Nadmiar w komórkach nowotworowych i bakteriach utrudnia leczenie.

Endocytoza (pobieranie w pęcherzykach otoczonych błoną)

• Fagocytoza: cząstki stałe (bakterie, komórki apoptotyczne, fragmenty komórek); wypustki otaczają cząstkę → fagosom → fuzja z lizosomem → fagolizosom. Makrofagi, neutrofile.
• Pinocytoza: pobieranie płynu pozakomórkowego z rozpuszczonymi substancjami; pęcherzyki pinocytarne ok. 80 nm (Junqueira). Pęcherzyk łączy się z endosomem/lizosomem albo przechodzi przez komórkę.
• Endocytoza zależna od receptorów: ligand wiąże swoisty receptor; kompleksy skupiają się w dołkach okrytych (opłaszczonych) klatryną (z białkami adaptorowymi; odcięcie pęcherzyka przez dynaminę) → pęcherzyk okryty → płaszcz klatrynowy się odłącza → fuzja z endosomem. Przykład: LDL (receptor wraca do błony), transferyna; receptor EGF jest degradowany razem z ligandem.
• Endocytoza przez kaweole (kaweoliny).
• Transcytoza (transport tranzytowy): pęcherzyk przenosi zawartość z jednej powierzchni komórki na drugą bez wykorzystania (śródbłonek, miocyty gładkie; pęcherzyki 65–120 nm).

Przedział endosomalny

Endosomy wczesne (przy błonie; tu receptor oddziela się od ligandu i może wrócić do błony) → endosomy późne (głębiej, niższe pH, ciała wielopęcherzykowe) → fuzja z lizosomami. Ruch pęcherzyków kontrolują małe GTPazy Rab. Los ładunku zależy m.in. od stopnia ubikwitynacji. Egzosomy (< 120 nm) powstają z ciał wielopęcherzykowych i są uwalniane poza komórkę.

Egzocytoza

Fuzja pęcherzyka z błoną komórkową i uwolnienie zawartości. Konstytutywna (ciągła, zaraz po syntezie, np. kolagen, przeciwciała z plazmocytu) i regulowana (produkt magazynowany w ziarnach i uwalniany na sygnał, zwykle po wzroście Ca²⁺ w cytoplazmie: enzymy trzustki, neuroprzekaźniki w synapsie, hormony).

Fuzja błon

Połączenie dwuwarstw dwóch błon w jedną (endocytoza, wydzielanie, zapłodnienie, łączenie mioblastów, komórki olbrzymie). Wirus grypy: hemaglutynina wiąże kwas neuraminowy, wirus jest endocytowany, w niskim pH endosomu peptydy fuzyjne (16–26 hydrofobowych aminokwasów) powodują fuzję otoczki z błoną endosomu i RNA wirusa trafia do cytoplazmy. Fuzja komórek w laboratorium daje heterokariony i hybrydomy.

• Endokrynna: hormon przez krew do odległych komórek.
• Parakrynna: ligand dyfunduje lokalnie i jest szybko rozkładany.
• Synaptyczna: odmiana parakrynnej; neuroprzekaźnik przez szczelinę synaptyczną.
• Autokrynna: ligand działa na komórkę, która go wydzieliła.
• Jukstakrynna: ligand zakotwiczony w błonie; potrzebny bezpośredni kontakt komórek.

Receptory

• Związane z kanałami (jonotropowe): po związaniu liganda otwierają kanał.
• Enzymatyczne (katalityczne): zwykle kinazy białkowe (np. receptor insuliny, kinaza tyrozynowa).
• Sprzężone z białkami G (metabotropowe): aktywowane białko G przyłącza GTP, podjednostka α oddysocjowuje i aktywuje efektor, np. cyklazę adenylanową → cAMP; podjednostka α ma aktywność GTPazy (sama się wyłącza).
• Wewnątrzkomórkowe: dla ligandów lipofilnych (steroidy, hormony tarczycy), działają jako czynniki transkrypcyjne.

Informatory (przekaźniki) II rzędu: cAMP, cGMP, diacyloglicerol (DAG), trifosforan inozytolu (IP₃), Ca²⁺, ceramid. Aktywują kinazy, które fosforylują białka docelowe. Ligand = informator I rzędu.

Rybosomy

Ok. 20 × 30 nm, bez błony; rRNA + białka. Mała podjednostka 40S (1 rRNA, ~30 białek), duża 60S (3 rRNA, ~50 białek); razem 80S. Podjednostki składane w jąderku. Wiele rybosomów na jednym mRNA = polirybosom (polisom); grupy fosforanowe rRNA nadają cytoplazmie zasadochłonność.

• Wolne polisomy: białka cytozolu, jądra, cytoszkieletu, mitochondriów i peroksysomów (na własne potrzeby komórki).
• Na RER: białka wydzielnicze, błonowe i lizosomalne (na eksport i do błon).

Siateczka śródplazmatyczna szorstka (RER)

• Spłaszczone cysterny z rybosomami na powierzchni cytoplazmatycznej (przyczepione przez ryboforyny). Ciągła z zewnętrzną błoną otoczki jądrowej i z SER.
• Sekwencja sygnałowa → SRP → receptor SRP i translokon → białko wchodzi do światła cysterny w trakcie translacji.
• Funkcje: synteza białek wydzielniczych, błonowych i enzymów lizosomalnych; wstępna (N-)glikozylacja; tworzenie mostków disiarczkowych; fałdowanie z udziałem białek opiekuńczych (chaperonów); składanie białek wielołańcuchowych; kontrola jakości (białka źle sfałdowane wracają do cytozolu i są niszczone w proteasomach); transport do AG.
• Dobrze rozwinięta w komórkach wydzielających białka: plazmocyty, komórki pęcherzykowe trzustki, fibroblasty, osteoblasty, chondrocyty, neurony (ciałka Nissla). Nie ma jej w plemnikach.

Siateczka śródplazmatyczna gładka (SER)

• Kanaliki i pęcherzyki bez rybosomów, bez spłaszczonych cystern.
• Funkcje: synteza fosfolipidów, cholesterolu i hormonów steroidowych (komórki Leydiga, kora nadnercza); detoksykacja (alkohol, barbiturany, leki; enzymy cytochromu P450, hepatocyty); metabolizm glikogenu (glukozo-6-fosfataza); magazynowanie i uwalnianie Ca²⁺ (w mięśniach jako siateczka sarkoplazmatyczna, Ca²⁺ związany z kalsekwestryną, uwalniany przez receptory rianodynowe); udział w tworzeniu składników żółci.

• Stosy spłaszczonych, gładkich cystern (diktiosomy) z pęcherzykami; zwykle przy jądrze, w pobliżu centrosomu. W komórce zwykle jeden, rozbudowany.
• Biegun cis (przyjmujący, od strony RER/jądra; sieć cis) → cysterny środkowe → biegun trans (wysyłkowy, sieć trans, TGN, od strony błony komórkowej).
• Transport pęcherzyków: COP-II = z RER do AG (do przodu); COP-I = wstecz (AG → RER i między cysternami); klatryna = pęcherzyki z sieci trans do endosomów i lizosomów.

Funkcje (ostatni etap biosyntezy białek)

• Modyfikacje potranslacyjne: glikozylacja (dalsza obróbka N-glikanów, O-glikozylacja), siarczanowanie (GAG, reszty tyrozyny), fosforylacja (np. mannozo-6-fosforan = adres dla enzymów lizosomalnych), ograniczona proteoliza (np. proinsulina → insulina).
• Sortowanie i pakowanie białek: do lizosomów, do błony komórkowej, do ziaren wydzielniczych lub do wydzielania konstytutywnego.
• Tworzenie lizosomów pierwotnych, ziaren wydzielniczych, glikolipidów i sfingomieliny, składników glikokaliksu.

Ziarna wydzielnicze powstają przez zagęszczenie zawartości pęcherzyków po stronie trans; otoczone błoną, magazynują produkt do egzocytozy regulowanej. Ziarna z enzymami trawiennymi = ziarna zymogenu (trzustka, kwasochłonne w HE).

Lizosomy

• Pęcherzyki z jedną błoną, 0,05–0,5 µm; ponad 40 kwaśnych hydrolaz: proteazy (katepsyny), nukleazy, glikozydazy, lipazy i fosfolipazy, fosfatazy (fosfataza kwaśna = znacznik), sulfatazy.
• Pompa H⁺ w błonie utrzymuje pH ok. 4,5–5 (najniższe pH w komórce). Enzymy działają tylko w kwaśnym środowisku, więc cytozol (pH ~7,2) jest chroniony; silnie glikozylowane białka błony chronią ją od środka.
• Enzymy powstają w RER, w AG dostają mannozo-6-fosforan i receptory M6P kierują je do lizosomów.
• Lizosom pierwotny: świeżo z AG (trans), enzymy jeszcze nieaktywne, najwięcej enzymów, jednorodny. Lizosom wtórny (heterolizosom/autolizosom): po fuzji z endosomem, fagosomem lub autofagosomem; tu zachodzi trawienie. Produkty trawienia przechodzą do cytoplazmy. Ciałko resztkowe: niestrawione resztki; gromadzi się jako lipofuscyna (barwnik „starzenia”, autofluorescencja), zwłaszcza w długo żyjących komórkach: kardiomiocyty, neurony.
• Autofagia: zbędne lub uszkodzone organella otacza błona (z ER) → autofagosom → fuzja z lizosomem. Także mikroautofagia i autofagia zależna od chaperonów. Źródło substratów przy głodzeniu.
• Choroby spichrzeniowe: brak enzymu lizosomalnego → gromadzenie substratu (np. Tay-Sachs, Gaucher, Pompe, choroba wtrętów I — błędne kierowanie enzymów bez M6P).

Proteasomy

• Kompleksy białkowe bez błony. Rdzeń: cylinder z 4 pierścieni po 7 białek (proteazy w środku); na każdym końcu cząsteczka regulatorowa z ATPazą, która rozpoznaje białko z ubikwityną i rozwija je.
• Ubikwityna (76 aminokwasów) przyłączana do lizyn białka przeznaczonego do degradacji; łańcuch poliubikwityny (≥ 4) = sygnał „do zniszczenia”. Ubikwityna wraca do puli.
• Niszczą pojedyncze białka: źle sfałdowane, uszkodzone, krótko żyjące (np. cykliny), a także fragmenty do prezentacji antygenów (MHC I). Lizosomy trawią całe organella i materiał z zewnątrz.

• Średnica 0,5–1 µm, długość 1–7 µm (do 10 µm); 12–25% objętości komórki; widoczne w mikroskopie świetlnym (kwasochłonne). Liczba zależy od zapotrzebowania na ATP: plemnik kilkadziesiąt, hepatocyt 1000–2500, oocyt ok. 200 000; mało w limfocytach, komórkach naskórka i starzejących się.
• Ruchliwe; w mięśniach w szeregach między miofibrylami, w nabłonkach transportujących (kanalik proksymalny, przewody prążkowane ślinianek) w pionowych szeregach w części podstawnej.
• Powstają przez wzrost i podział istniejących mitochondriów (nie de novo). Pochodzenie endosymbiotyczne (bakteria podobna do Rickettsia).

Obie błony łączą się w miejscach kontaktu (import białek). Białka kodowane w jądrze mają sekwencję sygnałową odcinaną przez peptydazy w mitochondrium.

• Grzebienie blaszkowate (płytkowe): większość komórek. Najwięcej i najgęściej w komórkach o dużym zużyciu ATP: kardiomiocyty (długie, nitkowate mitochondria, ciemna matriks = konfiguracja skondensowana), komórki nabłonka transportującego (jelito, kanalik proksymalny, komórki okładzinowe żołądka), neurony, komórki Schwanna i oligodendrocyty (synteza mieliny).
• Grzebienie cewkowate (tubularne): komórki steroidogenne: kora nadnercza, komórki Leydiga, komórki pęcherzyka jajnikowego, ciałko żółte. W mitochondriach zachodzi część syntezy steroidów (cytochrom P450scc zamienia cholesterol w pregnenolon).
• Brunatna tkanka tłuszczowa: liczne okrągłe mitochondria z gęstymi grzebieniami, dużo cytochromów, mało syntazy ATP. Termogenina (UCP-1) w błonie wewnętrznej rozprzęga transport elektronów od syntezy ATP: energia idzie w ciepło (noworodki).
• Plemnik: wydłużone mitochondria owinięte spiralnie wokół witki tworzą osłonkę mitochondrialną we wstawce, działającą jak jedno organellum.
• Konfiguracja ortodoksyjna (jasna matriks, mało grzebieni): stan spoczynku, niska fosforylacja; komórki starzejące się, niezróżnicowane, część nowotworowych.

Uszkodzenia (Seminaria)

• Obrzmienie (wakuolizacja): woda gromadzi się w mitochondrium, matriks jaśnieje i zanika, grzebienie się rozpadają (toksyny, wirusy, niedotlenienie).
• Struktury mielinopodobne: starzenie, degeneracja, toksyny.
• Hipertrofia, megamitochondria (miopatie, alkoholowa martwica wątroby, kardiomiopatie); fizjologicznie w endometrium w ciąży.
• Mitochondria piknotyczne: małe, o dużej gęstości elektronowej, cechy regresji; zmiany nieodwracalne (martwica).
• Kalcyfikacja: liczne gęste (osmofilne) ziarnistości w matriks (martwica, niedotlenienie mięśnia sercowego, CCl₄).

ATP to uniwersalny przenośnik energii swobodnej: dwa wiązania fosfobezwodnikowe, których hydroliza uwalnia dużo energii. Sama synteza ATP (ADP + P_i) jest niekorzystna termodynamicznie; napędza ją fosforylacja oksydacyjna na błonie wewnętrznej.

Ruchome przenośniki: ubichinon (koenzym Q), lipofilny, w błonie: z I i II (oraz z czółenka glicerolofosforanowego i β-oksydacji przez ETF) na III; cytochrom c, małe białko peryferyczne po stronie międzybłonowej: z III na IV. Kompleksy I, III, IV łączą się w respirasomy.

Potencjał redoks rośnie wzdłuż łańcucha: od NAD⁺/NADH (−320 mV) do ½O₂/H₂O (+820 mV), różnica 1,14 V; przeniesienie elektronów jest termodynamicznie korzystne.

Hipoteza chemiosmotyczna Mitchella (Nobel 1978)

Kompleksy I, III i IV pompują H⁺ z matriks do przestrzeni międzybłonowej. Powstaje gradient: ΔpH (matriks pH ~8, przestrzeń międzybłonowa ~7) i potencjał błonowy Δψ (180–200 mV). Razem to siła protonomotoryczna, która napędza syntezę ATP. Czynnik sprzęgający transport elektronów z fosforylacją = gradient H⁺.

Syntaza ATP

• F₁ (wystaje do matriks, „główka grzybka”): α₃β₃γδε; miejsca katalityczne w podjednostkach β. F₀ (w błonie, kanał protonowy; „oligomycynowa”): podjednostka a, 2 b, ~10 c.
• Motor molekularny: przepływ H⁺ przez półkanały między a i c obraca wirnik (c, γ, ε) względem stojana (a, b, δ, α₃β₃). Podjednostka γ obraca się skokami po 120° i zmienia konformację β: O (otwarta), L (luźne wiązanie), T (ścisłe, synteza). Boyer (Nobel 1997): energia gradientu jest potrzebna głównie do uwolnienia gotowego ATP z miejsca T.
• 3 H⁺ na 1 ATP; NADH → ok. 2,5 ATP, FADH₂ → 1,5 ATP. Dimery syntazy w kształcie litery V wyginają błonę i kształtują grzebienie.

Kontrola oddechowa

Szybkość oddychania jest sprzężona z syntezą ATP: dużo ADP przyspiesza syntazę, transport elektronów i zużycie O₂ (oraz cykl Krebsa, glikolizę, β-oksydację); dużo ATP hamuje. Wymaga sprawnej translokazy ADP/ATP. Współczynnik kontroli oddechowej = szybkość oddychania z ADP / bez ADP; im wyższy, tym lepsze sprzężenie.

Trzy sposoby zatrzymania fosforylacji oksydacyjnej

1. Zablokowanie syntazy ATP: oligomycyna (wiąże białko OSCP na styku F₀/F₁).
2. Zablokowanie wymiany ADP/ATP: atraktylozyd, karboksyatraktylozyd, kwas bongkrekowy (translokaza nukleotydów adeninowych).
3. Rozprzęgnięcie: rozprzęgacze (protonofory) DNP, FCCP przenoszą H⁺ do matriks z pominięciem syntazy; elektrony płyną, O₂ jest zużywany, ale energia ucieka w ciepło (DNP w „cudownych” środkach odchudzających: niebezpieczny). Fizjologiczny rozprzęgacz: termogenina.

• mtDNA: kolisty, dwuniciowy (nić ciężka H, lekka L), 16 569 pz, bez intronów i bez histonów; koduje 2 rRNA, 22 tRNA i 13 białek łańcucha oddechowego i syntazy ATP (7 podjednostek kompleksu I, 1 z III, 3 z IV, 2 syntazy). Pozostałe białka kodowane w jądrze. Pętla D = start replikacji i transkrypcji.
• mtDNA łatwo ulega uszkodzeniom: brak histonów, mało antyoksydantów, słaba naprawa, blisko źródła reaktywnych form tlenu.
• Heteroplazmia: w komórce współistnieją prawidłowe i zmutowane kopie mtDNA. Objawy pojawiają się, gdy udział zmutowanego mtDNA przekroczy próg, zależny od tkanki (najbardziej wrażliwe neurony i mięśnie). Diagnostyka: wybór odpowiedniej tkanki, ocena stosunku zmutowanego do prawidłowego mtDNA, badanie mtDNA i genomu jądrowego.
• Dziedziczenie matczyne (uniparentalne): mitochondria zarodka pochodzą z komórki jajowej. Mitochondria plemnika (ze wstawki) oocyt eliminuje: autofagia lizosomalna, degradacja mtDNA endonukleazami, proteoliza w proteasomach po ubikwitynacji (białka znakowane już w spermatogenezie).
• Przykłady chorób: LHON (neuropatia nerwu wzrokowego Lebera), MELAS, MERRF, NARP, zespół Leigha, zespół Kearnsa–Sayre'a, CPEO, zespół Pearsona, cukrzyca z głuchotą. Mutacje mtDNA wiąże się też ze starzeniem, Alzheimerem, Parkinsonem.

Inne funkcje mitochondriów

Synteza ATP · cykl Krebsa i β-oksydacja · apoptoza (uwolnienie cytochromu c przez megakanały w miejscach kontaktu, regulowane białkami rodziny bcl-2: pro- i antyapoptotycznymi) · buforowanie Ca²⁺ · steroidogeneza · synteza hemu · cykl mocznikowy (wątroba) · ketogeneza · wytwarzanie ciepła (brunatny tłuszcz) · aktywacja witaminy D (1-hydroksylaza w nerce).

• Kuliste, jedna błona, ok. 0,5 µm; drobnoziarnista matriks.
• Oksydazy utleniają substraty, przenosząc wodór na O₂ → powstaje H₂O₂; katalaza (znacznik) rozkłada H₂O₂ do wody i tlenu lub używa go do utleniania innych związków.
• Funkcje: β-oksydacja bardzo długołańcuchowych kwasów tłuszczowych; synteza plazmalogenów (fosfolipidy mieliny); udział w metabolizmie cholesterolu i syntezie kwasów żółciowych; detoksykacja (np. etanol, głównie w wątrobie i nerce).
• Powstawanie: pączkowanie pęcherzyków prekursorowych od ER lub wzrost i podział istniejących. Białka matriks importowane z cytozolu (sekwencje PTS).
• Choroby: zespół Zellwegera (brak importu białek), adrenoleukodystrofia (zaburzona β-oksydacja długołańcuchowych kwasów, uszkodzenie mieliny i nadnerczy).

Białka filamentów pośrednich

Centrosom, centriole, rzęski

• Centrosom = główny ośrodek organizacji mikrotubul (MTOC): dwie centriole ustawione prostopadle + materiał okołocentriolarny z γ-tubuliną. Centriola: walec ok. 0,2 µm średnicy, 0,3–0,5 µm długości, 9 tripletów mikrotubul (9 × 3), bez centralnych.
• Aksonema rzęski i witki: 9 dubletów + 2 centralne (9 × 2 + 2); ramiona dyneinowe (ruch), neksyna łączy dublety. Ciałko podstawne ma budowę centrioli (9 × 3).

Wtręty (inkluzje) cytoplazmatyczne: nagromadzenia substancji o niewielkiej lub żadnej aktywności metabolicznej, przeważnie magazyn. Nie są organellami.

• Substancje zapasowe: krople lipidowe (adipocyty, komórki steroidogenne; otoczone pojedynczą warstwą fosfolipidów, a nie pełną błoną), ziarna glikogenu (hepatocyty, mięśnie; w TEM gęste rozetki; PAS+).
• Barwniki: melanina (melanocyty, keratynocyty; ochrona przed UV), lipofuscyna (z ciałek resztkowych; kardiomiocyty, neurony; „barwnik starości”), hemosyderyna (żelazo po rozkładzie hemoglobiny; makrofagi śledziony, wątroby, szpiku; Perls+).
• Wydzieliny (ziarna wydzielnicze bywają zaliczane do wtrętów) i kryształy (np. kryształy Reinkego w komórkach Leydiga).